14分文章揭示吸烟对人类支气管上皮细胞功能和形态的影响（附细胞marker基因列表）| 单细胞专题

在进入正文前，小编告知小伙伴们一个振奋人心的消息：联川生物依托于海量的项目经验、文献和公共数据库，构建了自有细胞鉴定In-House Marker基因数据库（LC Auto Cell Type Marker，LC-ACTM），解决单细胞研究中“难鉴定、鉴定不全”的瓶颈问题，为单细胞数据挖掘提供强有力的保障！目前数据库仍在持续更新中，本文中关于人类支气管上皮细胞亚型的Marker基因已被收录进LC-ACTM中，详见文末！

2019年5月Science advances杂志刊发了一篇文章Characterizing smoking-induced transcriptional heterogeneity in the human bronchial epithelium at single-cell resolution，即从单细胞层面描述由吸烟引起的人支气管表皮细胞转录谱差异，影响因子14.136。人类支气管上皮组织由多种不同类型的细胞组成，包括基底细胞（Basal cell），棒状细胞（Club cell），杯状细胞（Goblet cell）和纤毛细胞（Ciliated cell），它们组成一道坚固的防线抵御环境的刺激。研究表明吸烟会改变支气管上皮细胞的功能和形态，但其对特定细胞类型和整体组织组成的确切影响尚不清楚。作者分别对6名吸烟者和6名不吸烟者的右侧主支气管上皮组织进行取样，接着采用流式细胞术分选ALCAM+上皮细胞以及CD45+白细胞，每个样本各取84个上皮细胞的11个白细胞，共1140个细胞，对这些细胞进行单细胞测序。

图1支气管刷取自6例不吸烟者和6例吸烟者的右侧主支气管。采用荧光活化的细胞筛选仪(FACS)分离单细胞，制备单细胞RNA库并测序

细胞过滤后得到796个有效细胞（753 个上皮细胞和43 个白细胞）。由于细胞数量较少，作者通过与前人研究中的支气管大样本数据集进行相关性分析，发现两个数据集差异表达基因高度相关，表明这12个样本的数据集结果可靠，可以用于后续分析。作者进一步通过DLA（潜在狄利克雷分布）分析，划分出13个细胞簇和19个基因集，每个细胞簇有相似的基因表达谱，每一个基因集含有独特的基因表达模式。

图2 LDA将数据集分为13个细胞簇和19个基因集

接着作者利用已知的marker基因对这些细胞簇进行细胞类型鉴定，鉴定结果表明，C-2和C-4被注释为KRT5+Basal；C-5 和 C-11被注释为FOXJ1+Ciliated；C-1 和 C-8被注释为SCGB1A1+Club；C-3 被注释为MUC5AC+goblet；C-7被注释为CD45+ WBC；C13 被注释为CFTR+ Ionocytes。

图3 支气管上皮细胞marker基因可视化

接着作者利用这些鉴定出来的细胞群来进行下一步的分析，得到了以下4部分结果。

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一、吸烟诱导的支气管组织中基因表达变化，可能是由多种支气管细胞类型的改变驱动的。在以往的研究中，普通转录组分析仅能发现吸烟者支气管组织中基因表达谱的差异，而该研究作者通过单细胞测序发现，支气管上皮组织中的Ciliated cell, club cell, goblet cell 以及 basal cell高表达的基因集的表达量在从未吸烟者（NS）和正在吸烟者（CS）之间有明显差异。说明吸烟诱导的支气管组织中基因表达变化，可能是由多种支气管细胞类型的改变驱动的。

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二、纤毛细胞亚群鉴定以及吸烟引起的解毒反应
纤毛细胞游离面有许多纤毛和微绒毛，纤毛依赖ATP水解获得能量并通过调节向咽部作定向节律性摆动，将黏膜表面的黏液、尘埃等异物推向喉部，以吐痰的方式排出体外，使吸入的空气得以净化。对纤毛细胞亚群的鉴定目前鲜有研究报道，在该研究中，作者通过对纤毛细胞不同亚群的功能进行分析发现，C5 cluster高表达纤毛形成以及运动相关基因而C11 cluster高表达细胞周期相关基因，因此作者认为这两个cluster是纤毛细胞中具有不同功能的两个细胞亚群。作者通过单细胞表达谱分析得到GS-8 醛酮代谢相关基因ALDH3A1, AKR1C1, 和AKR1B10仅在吸烟组纤毛细胞C5 cluster中高表达，作者又通过免疫组化实验发现吸烟者气道中AKR1B10+ 纤毛细胞数量明显高于未吸烟者气道，因此作者认为纤毛细胞表达了一组特定的解毒基因来回应烟雾刺激。

图4 在纤毛细胞中观察到吸烟诱导醛酮代谢相关基因高表达

A：热图显示吸烟者和未吸烟者C5纤毛细胞亚群的GS-8基因的表达；B：从未吸烟者和吸烟者获得的支气管组织进行了AKR1B10、Ac-a- tub和KRT8的免疫染色；C：与未吸烟者相比，吸烟者的AKR1B10+ Ac-a- tub +细胞的组织长度增加。

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三、吸烟者支气管上皮club cell减少而goblet cell增加
Goblet cell是分散在上皮中的一种典型的粘液细胞，分泌物主要为糖蛋白，糖蛋白与水结合形成的黏液（mucus）覆盖于上皮游离面，起润滑和保护作用。Club cell具有分泌功能且可以充当干细胞的角色。作者通过单细胞表达谱以及免疫组化验证得到吸烟导致club cell 减少goblet cell增加，即club cell大量分化为goblet cell。在哮喘患者气道中，类似的表型导致了黏膜流动性减少，黏膜塞的形成，推测在吸烟者支气管上皮中，goblet cell增加也是非常重要的表型。

图5 吸烟与支气管上皮中杯状细胞增多和杆状细胞减少有关

A：未吸烟者（NS）、表型正常吸烟者（MN）组织和杯状细胞增生吸烟者（GCH）的免疫染色代表图像；B：NS及MN、GCH吸烟者组织中MUC5B+、MUC5B+ MUC5AC+、MUC5AC+细胞的平均比例。

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四、吸烟者的支气管上皮含有一群未被报道的PG细胞亚群CEACAM5+ KRT8+ MUC5AC-为特征的C9亚群在吸烟组富集且无法与已有的细胞类型（如基底细胞，杯状细胞，纤毛细胞等）相匹配。作者首先通过单细胞表达谱数据发现，GS-15基因集在C9和goblet cell中高表达，推测C9可能与goblet 细胞有功能上的联系。进一步通过免疫组化实验发现：1.C9亚群在吸烟组支气管上皮杯状细胞增生（GCH）区域富集；2.C9与goblet以及ciliated在形态上有很大区别；3.在吸烟组支气管上皮的GCH区域，C9总是出 现在goblet cell附近，因此判定PG细胞与抽烟引起的goblet细胞增生有关，将C9细胞群命名为peri-goblet（PG）cells。在小鼠中KRT8+ Suprabasal cell在正常的基底细胞分化中，充当纤毛细胞和分泌细胞的中间前体。GCH的发生和维持可能需要杯状细胞的前体亚群，PG cell或许充当着杯状细胞前体亚群的角色，具体作用还有待进一步的挖掘。此外，PG cell的marker基因CEACAM5在戒烟后持续高表达，因此作者认为PG细胞的扩张的不可逆可能是慢性疾病状态的基础。

图6 在吸烟者的气道中观察到一个未被报道的PG细胞亚群

A：热图显示C-9和C-3中基因集GS-12、GS-16、GS-15的表达情况；B、C：TSNE可视化CEACAM5的表达情况；D：未吸烟者和吸烟者支气管组织的CEACAM5、KRT8和MUC5AC的免疫染色。箭头指示PG（CEACAM5+KRT8 +MUC5AC−）细胞；E：相对于从不吸烟者，吸烟者GCH组织中的CEACAM5+KRT8+MUC5AC−细胞的组织长度显著增加。

小结：


人类支气管上皮由多种不同类型的细胞组成，它们共同抵御环境的伤害。虽然研究表明，吸烟会改变支气管上皮的功能和形态，但其对特定细胞类型和整体组织组成的确切影响尚不清楚。作者使用单细胞RNA测序分析了6名未吸烟者和6名吸烟者的支气管上皮细胞。通过无监督分析，发现一组在纤毛细胞中特异高表达的毒素代谢相关基因；吸烟者支气管组织重塑与club cell减少，goblet cell增加相关；在吸烟者中鉴定出一个未被报道的peri-goblet上皮细胞亚群，该亚群表达支气管癌前病变标记。数据结果表明，暴露在烟雾中会导致复杂的细胞改变，从而引起人类支气管上皮疾病。最后，奉上这篇文献所使用的人支气管上皮组织不同细胞类型的marker基因，已被收录进LC-ACTM中，云工具链接：https://www.omicstudio.cn/tool/ten_x/show?path=demo&id=47

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